Чтобы клетки постоянно нарабатывали защитный пептид, авторы использовали технологию CRISPR/Cas9, компоненты которой: белок Cas9, гидовую РНК и ДНК-матрицу для репарации – вводили в клетки с помощью электропорации. Конструкцию доставляли в ген CXCR4 – один из ко-рецепторов, используемых ВИЧ для проникновения в клетку. Параллельный нокаут CXCR4 позволил усилить противовирусное действие пептида. На Т-клеточной линии СЕМ было показано, что пептиды, особенно в комбинации друг с другом при биаллельном нокине, полностью защищают клетки от различных вариантов ВИЧ. Однако получить высокий уровень желаемой модификации в первичных лимфоцитах человека оказалось трудной задачей. Сначала этот уровень составлял всего 1% против 30% в клетках СЕМ. Для более эффективного редактирования ученые ввели различные изменения в донорскую конструкцию, а также добавили второй сигнал ядерной локализации в белок Cas9. В результате уровень нокина в первичных клетках повысился в четыре раза.
Предложенный подход вносит вклад в развитие генотерапии ВИЧ и совершенствование методов направленного редактирования генома. Работа опубликована в журнале mBio.
Читать статью